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荧光定量PCR试剂盒熔解曲线出现多峰的原因及解决方法介绍

发布时间: 2022-07-04  点击次数: 312次
  荧光定量PCR是目前分子生物学研究中常使用的技术手段之一,荧光定量PCR试剂盒反应特异性高,能有效避免非特异扩增,提高实验效率。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性,酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性,又保留酶的活性。
 
  下面咱们来了解下荧光定量PCR试剂盒熔解曲线出现多峰的原因及解决方法:
 
  较为理想的熔解曲线是单峰曲线,如出现多峰有以下原因:
 
  1、非特异性扩增:主要原因为引物特异性不好、Tm值较低或模板质量不高,可以根据设计原则设计新引物或者通过梯度PCR对引物退火温度(Tm值)进行优化,上调Tm值,选购质量较好的离心柱法核酸提取试剂,提高核酸提取质量,等等。
 
  2、引物二聚体可通过琼脂糖凝胶电泳确认引物二聚体。引物二聚体在凝胶的底部形成扩散条带,通常位于100bp以下。引物二聚体在熔解曲线内峰值一般位于75℃左右,如该峰显著请按照以下方面进行优化:
 
  (1)优化扩增条件,如提高退火温度,可利用梯度PCR,摸索Tm值。通常两步循环(由95℃变性步骤直接进入60℃退火和延伸步骤)有利于强效扩增,因此引物设计时设定的成功退火温度为60℃。
 
  (2)引物浓度太高,适当降低引物浓度。通常引物的Tm低于目的基因,熔解曲线上峰值在目的基因峰的左边。大多数情况下,每条引物的理想浓度为200nM,但如有需要,可将浓度降至60nM。
 
  (3)cDNA模板带有基因组DNA污染:重新制备cDNA模板。在RNA提取完成后加入DNase对RNA进行处理,然后逆转录为cDNA。
 
  如果排除以上原因还是出现熔解曲线多峰的情况,就要考虑及时更换试剂盒,避免耽误实验进度。

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